轉(zhuǎn)基因分子特征的研究方法

——植物遺傳轉(zhuǎn)化過程中插入的變異

    通過一定的技術(shù)手段將外源基因整合到植物基因組的過程稱為植物的遺傳轉(zhuǎn)化。絕大多數(shù)植物遺傳轉(zhuǎn)化涉及組織培養(yǎng)。而植物組織培養(yǎng)涉及多種植物生長調(diào)劑、抗生素及篩選試劑，這些試劑可能造成轉(zhuǎn)化植株變異。而轉(zhuǎn)化途徑本身包括農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化及基因槍法也會造成轉(zhuǎn)化植株的變異。轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)的變異可以分為兩種類型：發(fā)生在轉(zhuǎn)基因整合位點(diǎn)的變異（稱為插入位點(diǎn)突變，insertion-site mutations）和發(fā)生在其它隨機(jī)位點(diǎn)的變異（稱為基因組范圍的突變，genome-wide mutations）。本文首先對插入位點(diǎn)突變進(jìn)行介紹。

{C}一、           {C}農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化中的插入位點(diǎn)突變(Insertion-site mutations resulting from Agrobacterium-mediated transformation)

農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)使用歷史已經(jīng)超過20年，被用于培育多種商業(yè)化轉(zhuǎn)基因作物。一些研究表明T-DNA插入突變可能造成染色體重組和受體DNA缺失。Forsbach等研究112個獨(dú)立的擬南芥轉(zhuǎn)化事件，研究表明絕大多數(shù)轉(zhuǎn)基因整合可能導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因整合位點(diǎn)基因組DNA的少量缺失，部分轉(zhuǎn)基因事件伴隨著基因組DNA的重組或者植物染色體DNA的缺失。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化還可能伴隨著冗余DNA（superfluous DNA）的插入。冗余DNA可能是額外的轉(zhuǎn)基因的全部或者部分片段、載體骨架DNA或者filler DNA。Filler DNA是指在DNA和DNA的連接處形成的新的DNA片段。Filler DNA可能與T-DNA或者轉(zhuǎn)基因有部分同源性，也可能與臨近的基因組DNA有部分同源性或者與任何DNA片段沒有同源性。

{C}二、           {C}基因槍介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化中插入位點(diǎn)突變（Insertion-site mutations generated by particle bombardment）

基因槍介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法也是常用的遺傳轉(zhuǎn)化方法。基因槍介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法獲得的轉(zhuǎn)基因事件通常較為復(fù)雜并且伴隨著大量拷貝的轉(zhuǎn)基因插入。大量研究表明基因槍介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化可能導(dǎo)致染色突變、基因DNA重組或者基因組DNA缺失。通常基因槍介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化相比農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化打亂植物基因組DNA及整合冗余DNA的概率更高。

{C}三、           {C}插入位點(diǎn)突變對植物的影響

插入位點(diǎn)突變可能會造成植物重要性狀的失去、獲得或者錯誤表達(dá)。當(dāng)轉(zhuǎn)基因插入伴隨著基因重組、冗余DNA的插入，這些序列與啟動子序列相鄰并且發(fā)生表達(dá)時可能會導(dǎo)致正義或者反義轉(zhuǎn)錄本的產(chǎn)生，類似siRNAs和miRNAs，可以導(dǎo)致RNA干涉的發(fā)生，影響植物的表型。復(fù)雜的轉(zhuǎn)基因整合還可能導(dǎo)致異常轉(zhuǎn)錄本產(chǎn)生并且產(chǎn)生融合蛋白，從而產(chǎn)生突變表型。當(dāng)轉(zhuǎn)基因富含啟動子時，轉(zhuǎn)基因可能會影響插入位點(diǎn)上游或者下游基因的表達(dá)。

為了提高轉(zhuǎn)基因作物的安全性及提高轉(zhuǎn)基因植物在基因功能研究中的可靠性，有必要對轉(zhuǎn)基因的分子特征進(jìn)行詳細(xì)的研究。